1. Die zu kryokonservierenden Zellen sollten sich in einem Zustand guten Wachstums (log-Phase) und hoher Überlebensrate mit einer Dichte von etwa 80-90 % befinden.
2. Prüfen Sie vor dem Einfrieren, ob die Zellen ihre einzigartigen Eigenschaften behalten.
Beispielsweise sollten Hybridome ein bis zwei Tage vor der Kryokonservierung auf Antikörperproduktion getestet werden.
3. Achten Sie auf die Qualität des Kryoschutzmittels.
DMSO sollte analysenrein, steril und farblos sein (gefiltert mit 0,22 Mikron FGLP Telflon oder direkt gekauften sterilen Produkten, wie Sigma D-2650), in kleinen Volumina von 5-10 ml aliquotiert und bei 4 oC im Dunkeln gelagert werden. Nicht mehrfach auftauen. Glycerol sollte ebenfalls analysenrein sein und nach dem Autoklavieren im Dunkeln gelagert werden. Nach dem Öffnen innerhalb eines Jahres verbrauchen, da es nach längerer Lagerung zelltoxisch ist.
4. Zellkonzentration für die Kryokonservierung:
(1) Normaler menschlicher Fibroblast: 1~3 x 106 Zellen/ml
(2) Hybridom: 1~3 x 106 Zellen/ml, die Zellkonzentration sollte nicht zu hoch sein, einige Hybridome sterben aufgrund der hohen Gefrierkonzentration nach 24 Stunden Auftauen ab.
(3) Anhaftende Tumorlinien: 5~7 x 106, abhängig vom Zelltyp. Adenokarzinom erfordert eine höhere Konzentration nach dem Auftauen, während HeLa nur 1-3 x 106 Zellen/ml benötigt.
(4) andere Suspensionen: 5~10 x 106 Zellen/ml, menschliche Lymphozyten müssen mindestens 5 x 106 Zellen/ml aufweisen.
5. Die Kryoschutzmittelkonzentration beträgt 5 oder 10 % DMSO. Wenn die Gefrierbedingungen der Zellen unsicher sind, sollte während der Kryokonservierung eine Backup-Kultur verwendet werden, um ein Versagen des Gefrierens zu verhindern.
6. Einfriermethode:
(1) Herkömmliche Methode: 4 oC 10 Minuten ---> -20 oC 30 Minuten ---> -80 oC 16-18 Stunden (oder über Nacht) ---> Langzeitlagerung in der Dampfphase des Flüssigstickstofftanks .
(2) Programmkühlung: Verwenden Sie eine Kühlmaschine mit konstanter Geschwindigkeit, um von Raumtemperatur auf –120 oC mit einer Geschwindigkeit von –1 ~ -3 oC/min zu reduzieren, und lagern Sie sie lange in der Dampfphase eines Flüssigstickstofftanks. Laufzeitspeicherung. Es eignet sich zur Konservierung von Suspensionszellen und Hybridomen.
7. Materialien:
(1) Kultivierte Zellen, die gut wachsen
(2) Frisches Medium
(3) DMSO (Sigma D-2650)
(4) Steriles Kryokonservierungsröhrchen aus Kunststoff (Nalgene 5000-0020)
(5) 0,4 % Gew./Vol. Trypanblau (GibcoBRL 15250-061)
(6) Hämozytometerplatte und Deckglas
(7) Kühlmaschine mit konstanter Geschwindigkeit (KRYO 10 Series II)
8. Schritte:
(1) Einen Tag vor dem Einfrieren die halbe oder ganze Menge des Mediums wechseln und das Zellwachstum beobachten.
(2) Zubereitung der Kryokonservierungslösung (Zubereitung vor der Verwendung): Fügen Sie DMSO zu frischem Medium hinzu, die Endkonzentration beträgt 5–10 %, mischen Sie gut und stellen Sie es zur späteren Verwendung auf Raumtemperatur.
(3) Sammeln Sie die kultivierten Zellen entsprechend dem Vorgang der Zellsubkultur und nehmen Sie eine kleine Menge Zellsuspension (etwa 0,1 ml), um die Zellkonzentration und Überlebensrate vor dem Einfrieren zu zählen.
(4) Zentrifugieren, Überstand entfernen, eine geeignete Menge Kryokonservierungslösung zugeben, um die Zellkonzentration auf 1-5 x 106 Zellen/ml einzustellen, gut mischen und in das etikettierte Kryokonservierungsröhrchen geben, 1 ml/Fläschchen, und ein kleines nehmen Menge an Zellsuspension für den Kontaminationsnachweis.
(5) Kryokonservierungsmethode 1: Das Kryoröhrchen wird 10 Minuten lang bei 4 oC gelagert → 30 Minuten lang bei -20 oC → 16 bis 18 Stunden lang (oder über Nacht) bei -80 oC → Flüssigstickstofftank-Dampfphase zur Langzeitlagerung.
(6) Gefrierlagerungsmethode 2: Das Gefrierrohr wird in eine Konstantgeschwindigkeitskühlmaschine mit einem festgelegten Programm und dann in einen Flüssigstickstofftank gegeben.
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