Summary: Nachdem ein Labor eine neue Zelllinie erhalten hat, muss die Zelllinie zuerst kultiviert und expandiert und dann eingefroren werden. Die Kryokonservierung von Zellen kann zunächst als Backup dienen, wenn Zellen aufgrund von Umweltverschm......
Nachdem ein Labor eine neue Zelllinie erhalten hat, muss die Zelllinie zuerst kultiviert und expandiert und dann eingefroren werden. Die Kryokonservierung von Zellen kann zunächst als Backup dienen, wenn Zellen aufgrund von Umweltverschmutzung und anderen Bedingungen verloren gehen. Darüber hinaus unterliegen fast alle Zellen während des Kultivierungs- und Passageprozesses einem gewissen Grad an Variation. Um die Konsistenz der experimentellen Ergebnisse aufrechtzuerhalten, können Zellen im Allgemeinen nicht über Dutzende von Generationen kultiviert werden. Bei erneuter Verwendung müssen die kryokonservierten, weniger passagierten Zellen vor der Verwendung aufgetaut und kultiviert werden.
Beim Einfrieren von Zellen gibt es vier Hauptpunkte: Zellernte, Verwendung von Schutzmitteln, Einfriergeschwindigkeit und Lagerumgebung.
Zellernte
Die für die Kryokonservierung verwendeten Zellen werden im Allgemeinen ausgewählt, wenn die Zellen zu ungefähr 90 % konfluent sind. Zu diesem Zeitpunkt ist das Zellwachstum gut und die Anzahl der Zellen groß, und das Kulturmedium sollte 24 Stunden vor dem Ernten der Zellen gewechselt werden. Das Verfahren zum Ernten der Zellen für die Kryokonservierung ist das gleiche wie üblich. Zentrifugieren Sie bei 100 x g für 5 Minuten, um die Zellen zu sammeln und sie zu resuspendieren. Die lebenden Zellen werden gezählt. Verdünnen oder konzentrieren Sie auf das Zweifache der endgültigen Zellkonzentration für die Zellkonservierung (normalerweise 4-10 Millionen Zellen/ml), fügen Sie ein gleiches Volumen der Kulturmedium-Schutzmittel-Mischungslösung hinzu, die vorbereitet wurde, und mischen Sie vorsichtig und aliquotieren Sie sie in das Kryokonservierungsröhrchen, Kryokonservierung.
Verwendung von Schutzmitteln.
Bei der Kryokonservierung von Zellen wird DMSO im Allgemeinen als Schutzmittel verwendet. Bei der Kryokonservierung von Zellen beträgt die verwendete Endkonzentration von DMSO im Allgemeinen 5–15 %. Die Konzentration von DMSO in der Kryokonservierungslösung einer bestimmten Zelle kann bei ATCC gefunden werden. Bei besonders empfindlichen Zellen, insbesondere Hybridomzellen, kann es besser sein, bei der Kryokonservierung 95 % Serum und 5 % DMSO zu verwenden. Wenn Sie das Schutzmittel verwenden, verwenden Sie Kulturmedium oder Serum, um die doppelte Endkonzentration herzustellen, und mischen Sie es dann mit einem gleichen Volumen Suspensionszellkulturmedium. Einfrierrate der Zelle
Die Gefrierrate der Zellen wird am besten kontrolliert, um genügend Zeit für die Dehydratisierung der Zellen zu lassen, ohne durch übermäßige Dehydratisierung beschädigt zu werden. Für die meisten Zellen ist ein Temperaturabfall von 1 bis 3 °C pro Minute angemessen. Der übliche Vorgang besteht darin, die Zellen 1-2 Stunden lang bei -20 °C zu halten, sie dann über Nacht in den -80 °C-Kühlschrank zu stellen (wenn kein -80 °C-Kühlschrank vorhanden ist, können Sie stattdessen Trockeneis verwenden) und dann Transfer in den Flüssigstickstofftank oder unter -130 Langzeitlagerung im Kühlschrank bei ℃.
Speicherumgebung
Die Langzeitlagertemperatur von Zellen beträgt -130 ℃ oder weniger. Die Temperatur der gasförmigen Schicht im Flüssigstickstofftank liegt zwischen -140℃ und -180℃. Zellen können in der Gasschicht gelagert oder in flüssigen Stickstoff eingetaucht werden. Wenn möglich, ist es am besten, in der Gasschicht zu lagern, weil dadurch vermieden werden kann, dass flüssiger Stickstoff in das Gefrierlager gelangt. Das Röhrchen verursacht eine Explosion, wenn die Zellen herausgenommen werden (auf diese Weise kann jedoch nur eine kleine Menge Flüssigstickstoff im Flüssigstickstofftank gespeichert werden, der häufig nachgefüllt werden muss). Die Zellen können auch einige Monate im Kühlschrank bei -80 °C gelagert werden.
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